Главная \ Публикации \ О чем следует помнить при определении концентрации тропонина в крови? Д.С.Беневоленский

О чем следует помнить при определении концентрации тропонина в крови? Д.С.Бен...

О чем следует помнить при определении концентрации тропонина в крови? Д.С.Беневоленский специалист по продукции компании Radiometer Medical ApS (Дания)

Клиническая необходимость определения концентрации тропонина в крови. Определение концентрации сердечных тропонинов I или T в крови больного  – краеугольный камень современной лабораторной диагностики инфаркта миокарда. Согласно рекомендациям как Европейского общества кардиологов [1], так и Национальной академии клинической биохимии (США) [2] определение концентрации сердечных тропонинов следует проводить у всех больных с подозрением на острый коронарный синдром.  Сходные рекомендации приняты и Всероссийским научным обществом кардиологов. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 19 августа 2009 г. № 599н «Об утверждении порядка оказания плановой и неотложной медицинской помощи населению Российской Федерации при болезнях системы кровообращения кардиологического профиля» предписывает всем лечебно-профилактическим учреждениям, где оказывается неотложная помощь больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями, проводить определение уровня тропонинов «в экстренном (безотлагательном) порядке и в любое время суток». Такое внимание к тропонинам, а точнее к сердечным изоформам тропонинов I и T, определяется их уникальной биохимической структурой, что позволяет создать тест-системы с высочайшей клинической чувствительностью и специфичностью в отношении повреждения миокарда. В 2007 году решением наиболее авторитетных американских, европейских и международных кардиологических ассоциаций диагноз инфаркта миокарда был впрямую связан с повышением уровня тропонина в крови [3].

Согласно этому документу «термин инфаркт миокарда следует использовать при наличии данных о некрозе миокарда на фоне клинической картины, соответствующей ишемии миокарда». Причем под данными о некрозе миокарда понимается «выявление роста и/или падения уровня сердечных биомаркеров (предпочтительно тропонина) с, по крайней мере, одной величиной, превышающей верхний референтный предел», а достаточным свидетельством ишемии считается хотя бы одно из следующего:
•        Наличие симптомов ишемии;
•        Изменения ЭКГ, свидетельствующие о появлении ишемии (появление изменений ST-T или появление блока левой ножки пучка Гиса);
•        Развитие патологического зубца Q на ЭКГ;
•        Данные лучевой диагностики, свидетельствующие о потере жизнеспособного миокарда или появлении локального нарушения движения стенки.
Фактически предусматривается только один вариант постановки диагноза без определения уровня тропонинов: «внезапная, неожиданная сердечная смерть, включающая остановку сердца, часто с симптомами ишемии миокарда, и сопровождающаяся предположительно новым подъемом ST, или новой БЛНПГ, и/или выявлением нового тромба при коронарографии и/или аутопсии, но смерть, произошедшая до взятия проб крови, или до появления сердечных биомаркеров  в крови». Для диагностики острого инфаркта миокарда исключительно важно выявить рост и/или падение уровня тропонина, то есть «волну» концентрации, возникающую после появления участков некроза, причем хотя бы в одной точке эта концентрация должна быть выше верхнего референтного предела (ВРП) в течение первых 24 часов после болевого приступа [2].  Верхний референтный предел устанавливается на основе исследования группы не менее чем из  120 здоровых людей, не имеющих заболеваний сердца в анамнезе.  Для тропонинов I и T пороговым значением для выявления поражения сердца признана 99-я процентиль распределения полученных результатов, то есть  у 99 % здоровых людей уровень соответствующего аналита в плазме ниже этой величины. В идеале каждая лаборатория должна установить собственный ВРП для каждого анализатора, соответствующий местным особенностям населения.  Однако, учитывая сложность проведения такого исследования, допускается ориентироваться на цифры, приведенные производителями оборудования.

Согласно рекомендации Международной федерации клинической химии и лабораторной медицине (IFCC) аналитическая чувствительность метода должна быть примерно в 5 раз ниже клинически значимого порогового уровня [4]. Кроме того, общая погрешность, определяемая  коэффициентом вариации (CV), на ВРП не должна превышать 10%, иначе тест будет давать много ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов.  Устройства для внелабораторной диагностики (POCT-анализаторы) должны соответствовать тем же критериям [4].            
Использование 99-ой процентили распределения концентраций тропонина у здоровых людей  в качестве ВРП дает превосходную клиническую чувствительность и специфичность по отношению к острому инфаркту миокарда. В таблице 1  приведены эти величины для нового анализатора для внелабораторной диагностики неотложных состояний AQT90 FLEX компании Radiometer. В качестве пороговой величины, отличающей норму от патологии взята концентрация 0,023 мкг/л, соответствующая 99-ой процентили. 

Таблица 1. Клиническая чувствительность и специфичность по отношению к острому инфаркту миокарда на уровне ВРП (99-я процентиль)
При поступлении (0–2 часа) Через 6–9 часов после поступления
Чувствительность Специфичность Чувствительность Специфичность
65% 91% 91% 88%

Достаточно точное количественное определение уровня тропонина позволяет не только подтвердить некроз миокарда, но и установить степень риска серьезных осложнений и смерти с целью выбора наиболее адекватного метода лечения. На рисунке 1 представлен упрощенный алгоритм диагностики острого коронарного синдрома, принятый Европейским обществом кардиологов.

Поступление ® Боль в груди
Рабочий диагноз ® Подозрение на острый коронарный синдром
ЭКГ ® Стойкое повышение сегмента ST Нарушения  ST/T Норма или неопределенные изменения  ЭКГ
      ↓              ↘ ↙               ↓
Биохимия ®   Тропонин ↑ Тропонин отрицательный дважды
Стратификация риска ®   Высокий риск Низкий риск
Диагноз ® ИМ (+) ST ИМ (–) ST Нестабильная стенокардия
Лечение ® Реперфузия Инвазивное Неинвазивное

Рисунок 1.  Алгоритм обследования при остром коронарном синдроме [1]. Все современные клинические и лабораторные рекомендации не делают различий между тропонинами I и T с точки зрения диагностики инфаркта миокарда.

Трудности определения концентрации тропонинов в крови.
В крови здоровых людей концентрация этих белков крайне мала. Концентрация тропонина I на уровне ВРП примерно 3 000 000 000 меньше общей концентрации белков в плазме, в 5000 и в 300 раз меньше соответствующих концентраций других широко известных биомаркеров некроза – миоглобина и креатинкиназыMB.  Тройной комплекс  тропониновI,T иC, попадая из некротизированных кардиомиоцитов в кровь, распадается на свободный тропонинT и двойной комплекс из тропониновI иC. Это и есть основные формы тропонинов в крови. Однако уже внутри кардиомиоцитов начинается протеолитическое расщепление тропониновI иT[5].В крови протеолиз продолжается, что приводит к постепенному отщеплению концевых фрагментов молекул тропонинаI(рис. 2). Кроме того, тропонинI подвергается фосфорилированию /дефосфорилированию и окислению. Поэтому в крови циркулирует не собственно тропонин, а постоянно изменяющийся спектр его модифицированных фрагментов.Все имеющиеся на сегодняшний день методы определения концентрации тропонина основаны на иммунохимической реакции, так называемом сэндвич-анализе. Обычно используется 1–2  типа антител для связывания антигена и 1–2  типа детекторных антител, меченных каким-либо способом. Применяются мышиные моноклональные антитела, полученные против определенного эпитопа сердечного тропонина. Они способны связаться лишь с некоторыми фрагментами молекулы тропонина. Различия в наборах антител у разных производителей тестов – основная причина в разбросе абсолютных величин, получаемых разными тест-системами при  определении тропонина в крови больных. Специальный комитет Международной федерации клинической химии и лабораторной медицине (IFCC) совместно с Американской ассоциацией клинической химии (AACC) приложили немало усилия для стандартизации тестов на  тропонинI. Национальным институтом стандартов и технологий США  (NIST) был принят новый стандартный референтный материал для сердечного тропонинового комплекса человека SRM 2921, который должен помочь в будущей стандартизации тестов на тропонин.  При практически идеальной корреляции величин, полученных наилучшими тест-системами, абсолютная величина концентрации может различаться в  5–10 раз. Поэтому прямое сравнение абсолютных значений невозможно, а границы нормы должны быть определены отдельно для каждого метода. И хотя клиническая интерпретация результатов с учетом соответствующих референтных диапазонов в целом совпадает для всех тестов, эта ситуация создает очевидное неудобство. Остаются и «серые зоны», особенно в близкой к  ВРП области значений.  Частично это связано со статистической природой, получаемых данных, а частично с трудностью и неточностью определения ВРП, то есть 99-й процентили распределения концентрации в группе здоровых людей.  Тест-системы для определения  тропонинаT до недавнего времени выпускал только один производитель –RocheDiagnostics, поэтому результаты определения его концентрации разными анализаторами были сопоставимы. 

Анализатор Radiometer AQT90 FLEX впервые может определить как тропонин I, так и  тропонин T в одной пробе.

              Следует помнить о статистическом характере полученных в результате анализа величин, причем, чем ниже концентрация, тем больше погрешность определения. Например, если истинная концентрация тропонина в пробе составляет 0,039 мкг/л, а CV в этой точке равен 10%, то при идеальной работе анализатора по законам статистики из 1000  определений 956 попадут в интервал 0,031–0,047  мкг/л, но в одном случае полученная величина будет ниже 0,027 мкг/л, а еще в одном – выше 0,051 мкг/л.                 

Возможные ошибки при определении концентрации тропонинов в крови. Если лабораторные данные существенно расходятся с клинической картиной, то возможно, что это произошло в результате ошибки анализа.  

Преаналитические ошибки.  Преаналитический этап – источник примерно 60–70 % ошибок в экспресс-лаборатории[6].  Их причинами могут быть неправильная идентификация больного или пробы, ошибки забора пробы крови, использование неправильных пробирок или антикоагулянтов, неправильная обработка и хранение пробы. Значительного числа ошибок можно избежать при использовании стандартных средств забора крови, например вакуумных пробирок. При работе с сывороткой причиной ложно-положительных результатов определения тропонина могут быть наличиефибриновых сгустков в результате неполного свертывания крови, например убольных с коагулопатиями или получающих антикоагулянтную терапию. Причиной ошибок могут быть и другие микрочастицы в образце. Некоторые тест-системы очень чувствительны к гемолизу.

Анализатор Radiometer AQT90 FLEX работает со стандартными вакуумными пробирками большинства производителей, содержащими гепарин или ЭДТА, и не требует никакой обработки или раскапывания пробы крови, что экономит время и исключает значительную часть преаналитических ошибок.  Встроенный сканер распознает  штрих-код на пробирке.  Применение системы 1stautomatic позволяет связать данные о больном, пробе и операторе и передать их в информационную систему во время взятия пробы, что исключает ошибки идентификации.

 Аналитические ошибки. Неправильная работа анализатора – возможная причина аналитических ошибок. Прежде всего, необходимо убедиться, что анализатор откалиброван в соответствии с требованиями производителя, и что проведен надлежащий контроль качества. Скрытой причиной получения ложно-отрицательных или ложно-положительных результатов определения тропонинов может быть наличие интерферирующих веществ в пробе крови, например:гетерофильных антител, человеческих антител против антигенов животных, ревматоидного фактора и аутоантител к тропонину;эндогенных компонентов крови, таких как билирубин и гемоглобин;иммунных комплексов;высокой концентрации  щелочной фосфатазыГетерофильные антитела – это антитела, образующиеся против неизвестных антигенов (часто инородных белков). Человеческие антитела против антигенов животных – это циркулирующие антитела человека против белков животных. Сообщалось о циркулирующих антителах, специфичных к широкому спектру иммуноглобулинов животных, таких как мышь, крыса, кролик и другие. У больного эти антитела могут появиться вследствие разных причин, включая применение мышиных моноклональных антител для лучевой диагностики и лечения рака; контакт с микробными антигенами; контакт ветеринаров, фермеров и рабочих пищевой промышленности с инородными белками; присутствие в доме домашних животных. Аутоиммунные заболевания приводят к образованию таких аутоантител, как ревматоидный фактор (антитела кFc-фрагменту иммуноглобулиновG). Распространенность интерферирующих антител среди населения достаточно велика. Все эти находящиеся в крови антитела могут перекрестно взаимодействовать со связывающими и детекторными антителами тест-системы, приводя к положительному результату в отсутствие в пробе тропонина.Помимо этого, у 5,5% людей без признаков сердечно-сосудистых заболеваний и у 21% больных с острым коронарным синдромом были обнаруженыаутоантитела к тропонинуI [7]. Взаимодействуя с центральной частью молекулы тропонина, они могут блокировать связывание антител тест-системы, что иногда приводит к ложно-отрицательным результатам анализа.Из-за большого разнообразия интерферирующих антител какого-либо специфического теста, который мог бы подтвердить или исключить присутствие интерферирующих антител в пробе не существует. Лабораторные специалисты должны заподозрить наличие интерферирующих антител в тесте на тропонин, когда результат теста:расходится с клиническими данными о больном;не воспроизводится на той же или на другой тест-системе;результат нелинеен после серии разведений. 

Тест-система анализатора Radiometer AQT90 FLEX для предотвращения эффекта интерферирующих антител содержит мышиный IgG и бычий γ-глобулин. Одно из связывающих и детекторное антитела  тест-системы взаимодействуют с тропонином за пределами его центрального участка – мишени аутоантител к тропонину, что снижает влияние аутоантител на результаты анализа. В качестве способа получения сигнала от детекторных антител выбран чисто физический метод: флюоресценция хелата европия с временным разрешением.  Это исключает влияние избытка щелочной фосфатазы, отмеченного при ферментативном методе. Наконец, гемолиз не оказывает влияния на результаты анализа как тропонина I, так и тропонина T [8].

  Постаналитические ошибки. Обработка информации, сравнение с референтными диапазонами и передача данных лечащему врачу существенно упрощаются, а риск ошибок уменьшается при подключении анализатора к информационной системе.Важно помнить, что тропонины выходят в кровь не сразу после возникновения некроза. Поэтому результат определения тропонина может быть отрицательным на фоне очевидных признаков острого инфаркта миокарда, если забор проб крови производился в первые часы после начала болевого приступа. В то же время, анализ пробы крови сразу после поступления больного в приемное отделение дает важную клиническую информацию (Таблица 1).Важнейшая часть постаналитического этапа – помощь клиницистам в интерпретации полученных данных. Здесь необходим вдумчивый подход и выработка общих правил оценки результатов, полученных разными тест-системами, например, на портативных анализаторах у постели больного и в центральной лаборатории.Хотя повышение уровня тропонина в отсутствие острого инфаркта миокарда происходит довольно редко, оно может ввести врача в заблуждение. В случае сомнения в достоверности результата нужно постараться найти другую возможную клиническую причину повышения уровня тропонина, не связанную с инфарктом миокарда, повторно проанализировать клиническую картину и назначить дополнительные диагностические тесты. Возможные причины повышения концентрации тропонинов приведены в таблице 2.     

Таблица 2. Причины повышения уровня тропонина в отсутствие ишемической болезни сердца [3].
Ушиб сердца или другая травма вследствие хирургической операции, катетерной деструкции, электрокардиостимуляции и т.д.Застойная сердечная недостаточность – хроническая или остраяРасслаивание аортыПорок аортального клапанаГипертрофическая кардиомиопатияТахи- или брадиаритмии или атриовентрикулярная блокадаСиндром «разбитого сердца» (кардиомиопатия такоцубо) Рабдомиолиз с поражением сердцаТромбоэмболия легочной артерии, тяжелая легочная гипертензияПочечная недостаточностьОстрые неврологические заболевания, включая инсульт и субарахноидальное кровоизлияниеИнфильтративные заболевания, такие как амилоидоз, гемохроматоз, саркоидоз и склеродермияВоспалительные заболевания,  такие как миокардит или поражение миокарда при эндо- или перикардитеУпотребление наркотиков или токсических веществКритические состояния, особенно в сочетании с дыхательной недостаточностью или сепсисомОжоги, особенно, если они поражают >30% поверхности телаЧрезмерные физические нагрузки

  Что делать в случае сомнения в правильности определения тропонинов в крови?
1)      Прежде всего, нужно убедиться в правильности работы анализатора. Для этого необходимо проводить калибровки и техническое обслуживание с частотой, рекомендованной производителем. В случае сомнения, проведите измерение образцов контроля качества в соответствии с рекомендациями производителя. По меньшей мере, один контрольный образец должен соответствовать клинически значимой пороговой концентрации (ВРП) тропонина.
2)      Проверить правильность взятия пробы крови, и повторить взятие пробы и тестирование. Если анализатор проходит все контроли качества, забор пробы крови осуществляется в соответствии с инструкциями производителя, а результат анализа по-прежнему не соответствует клинической картине, то нужно попытаться найти скрытую причину в особенностях пробы или заболевания:
1)      Повторить анализ пробы после нескольких разведений и проверить линейность результатов, нарушение которой позволяет выявить интерферирующие антитела.
2)      Использовать имеющиеся в продаже гетерофильные блокирующие агенты (обычно это смесь иммуноглобулинов) или нормальную мышиную (или другого животного) сыворотку в качестве блокирующего агента. 3)      Проверить возможность негативного влияния билирубина и/или гемоглобина.
4)      По возможности, повторить анализ той же пробы с помощью другой тест-системы для проверки результата. Если нет другой тест-системы, то послать образец в другую лабораторию для проверки другим способом.
5)      Если имеется достаточное количество образца, сохранить часть пробы для дальнейшего тестирования в другой лаборатории или производителем.
6)      Обсудить с лечащим врачом противоречия между результатом анализа и клинической картиной. Повторно проанализировать клиническую картину и назначить дополнительные диагностические тесты (например, рассмотреть возможность другой причины боли в груди, повторить ЭКГ и т.д.), и постараться найти другую возможную клиническую причину повышения уровня тропонина, не связанную с инфарктом миокарда.  

ЛИТЕРАТУРА [1] Guidelines for the diagnosis and treatment of non-ST-segment elevation acute coronary syndromes. European Heart Journal (2007) 28, 1598–1660. [2] National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical Characteristics and Utilization of Biochemical Markers in Acute Coronary Syndromes. Circulation (2007) 115, e356-e375. [3] Thygesen K, Alpert JS, White HD on behalf of Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation (2007) 116(22), 2634-53. [4] Apple FS, Jesse RL, Newby LK, Wu AH, Christenson RH. National Academy of Clinical Biochemistry and IFCC Committee for Standardization of Markers of Cardiac Damage Laboratory Medicine Practice Guidelines: Analytical issues for biochemical markers of acute coronary syndromes. Circulation (2007) 115(13), e352-5. [5] Labugger R, Organ L, Collier Ch, Atar D, Van Eyk JE. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation (2000) 102, 1221-1226. [6] Carraro P, Plebani M. Errors in a stat laboratory: types and frequencies 10 years later.  Clinical Chemistry (2007) 53(7), 1338-42. [7] Pettersson K, Eriksson S, Wittfooth S, Engström E, Nieminen M, Sinisalo J. Autoantibodies to Cardiac Troponin Associate with Higher Initial Concentrations and Longer Release of Troponin I in Acute Coronary Syndrome Patients. Clinical Chemistry (2009) 55, 938-945. [8] Bais R. Characterisation of the Radiometer AQT90 Flex Troponin I and T Assays. Abstract AACB Conference 2010.        

Выбор антител

Рисунок 2. Факторы, влияющие на выбор антител для определения тропонина I.